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論文解讀--透明虎皮魚作為一種魚類模型分析諾卡氏菌體內感染

出處:水生動物健康評估公眾號 作者:王文基 水產養殖網 2020-04-06 22:56:00

諾卡氏菌侵染多種養殖魚類,給養殖業造成了巨大的經濟損失,但由于對疾病發病機制缺乏詳細的認識,阻礙了有效防控策略的制定。自1963年阿根廷首次報告魚諾卡氏菌病以來,對該病的研究主要集中在流行病學方面,目前還沒有廣泛有效的方法在感染早期能夠被發現或控制。魚類在發育早期通常是透明的,這一特性已被用于實時研究。如果用一種透明的魚來研究鰤魚諾卡氏菌侵染的過程,將能更好的理解鰤魚諾卡氏菌的致病機理。今天,和大家一起學習一篇用透明的虎皮魚來研究鰤魚諾卡氏菌的致病機理,引文信息如下:
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魚諾卡氏菌病是一種慢性感染性疾病,通常在發病初期并不伴有急性癥狀,但逐漸的組織侵犯最終會在腎臟、肝臟和脾臟等內臟器官形成結節性病變。由于水產養殖中無早期可見癥狀,病程較長,往往在養殖中期才發現諾卡菌病,由于投入了大量的設置成本和勞動力,且藥物療效較差,給養殖者造成了巨大的經濟損失。文章前期研究獲得一種突變型的虎皮魚,這種魚缺失色素細胞,全身透明。而且在相關研究中表明這種魚對鰤魚諾卡氏菌也是敏感的,因此文章借助這種特殊的魚,在體內研究鰤魚諾卡氏菌侵染宿主的動態過程,并通過觀察了解肉芽腫的形成。
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技術路線如下:

實驗魚共分成六組,每組20尾魚。利用生理鹽水調整菌液濃度為1.0 × 106, 1.0 × 107, 和 1.0 × 108 cfu/ml,每尾注射0.05 ml菌液,對實驗魚進行肌肉注射(三組)或腹腔注射(三組),每尾注射0.05 ml菌液,對照組注射等量的無菌生理鹽水。腹腔注射后,通常在感染后8天,肌肉和內臟出現肉眼可見的稀疏分布的點狀渾濁。這些不透明結節常見于腹腔、脊柱和鰭基周圍的肌肉組織,特別是頭部腎臟和腎臟區域(圖1B,1C)。肌肉注射也導致了白色不透明病變的形成。感染后6 ~ 8天,注射部位附近逐漸出現白色渾濁,病灶體積擴大,與周圍組織對比增強(圖1D)。
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圖1 鰤魚諾卡氏菌感染虎皮魚的癥狀

在光學顯微鏡下,濕式貼裝法和Ziehl-Neelsen染色法收獲的病結節顯示大量的紅色細菌絲。
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圖2病灶中大量鰤魚諾卡氏菌聚集

類似的白色不透明結節也出現在注射部位外,特別是腹腔內。累積死亡率隨細菌劑量和時間的增加而增加(圖3)。細菌生長和形態特征與從死亡魚中分離出的感染性細菌一致,經16S rRNA測序確認為鰤魚諾卡氏菌(N. seriolae)。肌肉注射比腹腔注射能更快地引起癥狀的出現和死亡。
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圖3不同劑量連續感染鰤魚諾卡氏菌的虎皮魚實驗累積死亡率

注射后12小時,從腹腔流出的腹腔液細胞內發現熒光細菌。部分細胞被GFP標記菌吞噬,呈現偽足和顆粒狀結構(圖4A和B),具有白細胞特征。這些結構特征與紅細胞特征不同,表明入侵細菌被白細胞(如巨噬細胞)內化。細胞內熒光細菌數量逐漸增多。感染后4天,腹腔內聚集了感染N. seriolae的白細胞(圖4C),并在血液中觀察到它們(圖4D)。雖然可以被虎皮魚的白細胞吞噬,但不能完全消滅,部分細菌仍能在細胞內增殖,導致免疫細胞進一步聚集。熒光標記細菌在血源性白細胞中的存在也表明內化細菌可以通過循環侵入其他組織,這可能是多器官病變最終出現的原因。在感染后期,在肌肉、脾臟(圖4E和F)、腎臟等組織中發現與體內白色渾濁病變位置相同的標記菌群,表明感染與白細胞分布密切相關。
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圖4 在虎皮魚體內追蹤被熒光標記的鰤魚諾卡氏菌

受感染的魚在肌肉、肝臟、脾臟、腎臟和腸道等多個器官表現為肉芽腫,壞死核心,無明顯的組織偏好。肉芽中心干酪樣壞死較明顯,纖維細胞和上皮細胞層較不明顯,尤其在感染劑量最高的組別。
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圖5 鰤魚諾卡氏菌感染虎皮魚后多器官出現肉芽腫

注射標記細菌后,在冰凍切片上更詳細地檢查了N. seriolae的組織分布。再次,在肌肉、脾臟、腸、腎和肝臟中檢測到gfplabnocardia。標記菌呈線性相關,分枝明顯,生長呈珊瑚狀,并逐漸向外周擴散。
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圖6 鰤魚諾卡氏菌聚集形成肉芽腫

本研究表明,細菌的胞內增殖和感染相關免疫細胞的聚集表明,虎皮魚與宿主細胞的相互作用與分枝桿菌感染相似。諾卡菌可通過血液循環遷移并在魚體內形成肉芽腫性病變。雖然似乎沒有優先感染的組織,但肝組織肉芽腫結構比脾和腎少,這可能是因為后者是白細胞的主要存儲器官。肉芽腫核心壞死,周圍上皮樣細胞很少,纖維細胞層很薄,病理特征與感染分枝桿菌的魚不同。由于感染源、宿主和感染方式不同,病理表現也有明顯差異,因此影響感染過程的因素值得進一步研究。

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